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ELISA實驗要點:ELISA溫育背后,藏著那些不一樣的選擇呢

更新時間:2023-12-12    點擊次數(shù):764

  ELISA實驗要點:ELISA溫育背后,藏著那些不一樣的選擇呢

 

  在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應(yīng),即加樣本和加酶結(jié)合物后??乖贵w反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時間,這一保溫過程稱為溫育(incubation),有人稱之為孵育。

  溫育的時間選擇:

  溫育這一步是ELISA測定中最容易出現(xiàn)問題的步驟。目前市面上的商品化試劑盒的反應(yīng)溫育時間一般為30~120分鐘,溫育時間若不夠,可能會影響測定下限。

  ELISA屬固相免疫測定,抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。以抗體包被的夾心法為例,加入板孔中的標(biāo)本,其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結(jié)合的機會,只有最貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個逐步平衡的過程,因此需經(jīng)擴(kuò)散才能達(dá)到反應(yīng)的終點。在其后加入的酶標(biāo)記抗體與固相抗原的結(jié)合也同樣如此。這就是為什么ELISA反應(yīng)總是需要一定時間的溫育。

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  在一定溫度范圍內(nèi),溫育所需時間與溫度成反比,即溫度越高,則所需時間相對較短。

  溫育的溫度選擇:

  溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃(冰箱溫度)等。37℃是實驗室中常用的保溫溫度,也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。

  在建立ELISA方法作反應(yīng)動力學(xué)研究時,兩次抗原抗體反應(yīng)一般在37℃經(jīng)1-2小時,產(chǎn)物的生成可達(dá)。為加速反應(yīng),可提高反應(yīng)的溫度,有些試驗在43℃進(jìn)行,但不宜采用更高的溫度。抗原抗體反應(yīng)4℃更為,在放射免疫測定中多使反應(yīng)在冰箱中過夜,以形成最多的沉淀。但因所需時間太長,在ELISA中一般不予采用。

  溫育的保溫選擇:

  溫育方式常采用溫箱法、微波輻射法和水浴法。其中水浴法能較好解決因受熱不均衡所致的周圍孔與中央孔結(jié)果的吸光度差異(“邊緣效應(yīng)"即外周孔顯色較中心孔深)??蓪LISA板置于水浴箱中,板底應(yīng)貼著水面,使溫度迅速平衡,為避免蒸發(fā),板上應(yīng)加蓋,也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔,此時可讓反應(yīng)板漂浮在水面上。

  若用溫箱,ELISA板應(yīng)放在濕盒內(nèi),濕盒要選用傳熱性良好的材料(如金屬等),在盒底墊濕的紗布,最后將ELISA板放在濕紗布上。濕盒應(yīng)先放在保溫箱中預(yù)溫至規(guī)定的溫度,特別是在氣溫較低的時候更應(yīng)如此。為避免酶標(biāo)板底部受水汽或磨損導(dǎo)致的讀數(shù)誤差,一般采用鼓風(fēng)恒溫箱保溫,這個過程必須在酶標(biāo)板上方貼封紙,以免蒸發(fā)。

  無論是水浴還是濕盒溫育,反應(yīng)板均不宜疊放,以保證各板的溫度都能迅速平衡。室溫溫育的反應(yīng),操作時的室溫應(yīng)嚴(yán)格限制在規(guī)定的范圍內(nèi),標(biāo)準(zhǔn)室溫溫度是指20-25℃,但具體操作時可根據(jù)說明書的要求控制溫育。

  室溫溫育時,ELISA板只要平置于操作臺上即可。應(yīng)注意溫育的溫度和時間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。為保證時間精確,一個人一次不宜多于兩塊板同時操作、測定。

  關(guān)于溫育,在實際測定操作中應(yīng)注意:

  ● 不同的溫育環(huán)境對檢測結(jié)果有影響,操作中應(yīng)嚴(yán)格按照說明書控制溫育時間及溫度,并注意封閉避免邊緣效應(yīng)。

  ● 為確保各板溫度都能迅速達(dá)到平衡,不可將反應(yīng)板疊加放置,設(shè)定的溫度及時間嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行,一般加入待測樣本后使其與固相抗原(抗體)置于37℃環(huán)境下溫育。因為很多恒溫箱的構(gòu)造,溫度及檢測的溫度并非酶標(biāo)板溫育溫度,所以使用恒溫箱溫育時建議將溫度計置于酶標(biāo)板旁,保證酶標(biāo)板旁溫度為37℃。

  ● 干育和水溫的影響差異較為明顯,建議使用水溫,注意將固相板放入水中,防止受熱不均勻。

  ● 試劑盒一般設(shè)定的反應(yīng)溫度為 37℃,在這個溫度下放置 30 分鐘,蒸騰的水分會許多,對于全部反應(yīng)體系來講,各種反應(yīng)物的濃度會不斷增加,這么必會致使反應(yīng)最終的OD值增加,溫育時貼封片或加蓋,避免標(biāo)本或稀釋液蒸發(fā)。

  ● 試劑盒設(shè)定的一定溫度下的反應(yīng)時間并不是反應(yīng)的終點,提高反應(yīng)的溫度,會加速反應(yīng),一樣延長時間會影響反應(yīng),這樣得到的反應(yīng)程度會比試劑盒斷定的反應(yīng)程度深,也會引起陰性高值或假陽性。

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