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冰凍切片DAB顯色原位雜交實驗步驟

更新時間:2024-01-08    點擊次數:3595

  冰凍切片DAB顯色原位雜交實驗步驟

  1.組織固定:組織取出PBS漂洗后立即放入原位雜交固定液(動物)中固定12h以上,4°保存運輸。

  2.脫水:固定后在通風櫥內切取目的區域組織塊約3mm厚,放入15%蔗糖溶液中8h,后換30%蔗糖溶液中過夜。

  3.冰凍切片固定:冰凍切片室溫晾干,置于原位雜交固定液(動物)固定10min,于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。

  4.修復及消化:根據組織類型,固定時間長短及指標的定位,選用不同的修復液進行修復,具體修復條件見上表。自然冷卻后組化筆畫圈,根據不同組織不同指標特性,滴加蛋白酶K(20ug/ml) 37°消化,消化時間見上表。純水沖洗后PBS洗3次,每次5min。

  5.阻斷內源性過氧化物酶:滴加3%甲醇-H2O2,室溫避光孵育15min,將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。

  6.預雜交:滴加預雜交液,37°C孵育1h。

  7.雜交:傾去預雜交液,滴加含探針雜交液, 恒溫箱雜交過夜。雜交條件見上表。

  8.雜交后洗滌:洗去雜交液,2×SSC,37°C 洗10min,1×SSC,37°C洗2×5min,0.5×SSC室溫洗10min。若非特異雜交體較多,可以增加甲酰胺洗滌。

  9.血清封閉:滴加封閉血清正常兔血清 室溫孵育30min。

  10.滴加HRP標記鼠抗digaoxin抗體(anti-DIG-HRP):傾去血清封閉液,滴加anti-DIG-HRP。37° 孵育50min,后PBS洗4次×5min。

  11.DAB顯色:切片稍甩干后,在圈內滴加新鮮配制的DAB顯色液,顯微鏡下控制顯色時間,陽性為棕黃色,純水沖洗切片終止顯色。

  12.復染細胞核:蘇木素染液復染3min左右,自來水洗,蘇木素分化液分化數秒,自來水洗,蘇木素返藍液返藍1min,流水沖洗。

  13.脫水封片:將切片依次放入75%酒精6min-85%酒精6min—100%酒精I 6min—100%酒精II 6min-正丁醇6min—二甲苯透明,將切片從二甲苯中拿出稍晾干后,封片劑封片。

  14.顯微鏡檢,圖像采集分析。

  術原理介紹

  采用digaoxin標記特異性的寡核苷酸序列作為探針。利用HRP(過氧化物酶)標記的抗digaoxin抗體與digaoxin標記的核酸雜交體結合。然后HRP催化DAB(二氨基聯苯胺)生成不溶于水的棕黃色產物,實現靶基因-探針雜交體的定位和定量。

  本產品僅供科研用途,不用于臨床診斷!

  注:以上資料僅供參考!

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