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植物1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(RubisCO)組成及操作步驟

更新時間:2022-09-02    點擊次數:2663


  植物1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(RubisCO)組成及操作步驟

  實驗原理

  本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中植物 1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(RubisCO)水平。 用純化的植物 1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(RubisCO)抗體包被微孔板,制成固相抗體,往包 被單抗的微孔中依次加入植物 1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(RubisCO),再與 HRP 標記的 1,5- 二磷酸核酮糖羧化酶(RubisCO)抗體結合,形成抗體-抗原-酶標抗體復合物,經過*洗 滌后加底物 TMB 顯色。TMB 在 HRP 酶的催化下轉化成藍色,并在酸的作用下轉化成最終 的黃色。顏色的深淺和樣品中的植物 1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(RubisCO)呈正相關。用酶 標儀在 450nm 波長下測定吸光度(OD 值),通過標準曲線計算樣品中植物 1,5-二磷酸核酮 糖羧化酶(RubisCO)濃度。

  試劑盒組成:

  1 30 倍濃縮洗滌液 20ml×1 瓶

  7 終止液 6ml×1 瓶 2 酶標試劑 6ml×1 瓶

  8 標準品(300ng/L) 0.5ml×1 瓶 3 酶標包被板 12 孔×8 條

  9 標準品稀釋液 1.5ml×1 瓶 4 樣品稀釋液 6ml×1 瓶

  10 說明書 1 份 5 顯色劑 A 液 6ml×1 瓶

  11 封板膜 2 張 6 顯色劑 B 液 6ml×1/瓶

  12 密封袋 1 個

  植物1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(RubisCO)組成及操作步驟 標本要求

  1.標本采集后盡早進行提取,提取按相關文獻進行,提取后應盡快進行實驗。若不能 馬上進行試驗,可將標本放于-20℃保存,但應避免反復凍融

  2.不能檢測含 NaN3 的樣品,因 NaN3 抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性。

  操作步驟

  1. 標準品的稀釋:本試劑盒提供原倍標準品一支,用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀 釋。

  150ng/L

  5 號標準品

  150μl 的原倍標準品加入 150μl 標準品稀釋液

  75ng/L

  4 號標準品

  150μl 的 5 號標準品加入 150μl 標準品稀釋液

  37.5ng/L

  3 號標準品

  150μl 的 4 號標準品加入 150μl 標準品稀釋液

  18.75 ng/L

  2 號標準品

  150μl 的 3 號標準品加入 150μl 標準品稀釋液

  9.375 ng/L

  1 號標準品

  150μl 的 2 號標準品加入 150μl 標準品稀釋液2. 加樣:分別設空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑,其余各步操作相同)、標準孔、 待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣 50μl,待測樣品孔中先加樣品稀釋液 40μl, 然后再加待測樣品 10μl(樣品最終稀釋度為 5 倍)。加樣將樣品加于酶標板孔底部,盡 量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻。

  3. 溫育:用封板膜封板后置 37℃溫育 30 分鐘。

  4. 配液:將 30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30 倍稀釋后備用

  5. 洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置 30 秒后棄去,如此 重復 5 次,拍干。

  6. 加酶:每孔加入酶標試劑 50μl,空白孔除外。

  7. 溫育:操作同 3。

  8. 洗滌:操作同 5。

  9. 顯色:每孔先加入顯色劑 A50μl,再加入顯色劑 B50μl,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色

  10 分鐘.

  10. 終止:每孔加終止液 50μl,終止反應(此時藍色立轉黃色)。

  11. 測定:以空白孔調零,450nm 波長依序測量各孔的吸光度(OD 值)。 測定應在加終止 液后 15 分鐘以內進行。


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